Una classe de endonucleases que trenca l'ADN després de reconèixer una seqüència específica, per exemple, Bam H1 (5´GGATCC3´), dIII Eco RI (5´GAATTC3´) i Hin (5´AAGCTT3´). Hi ha tres tipus d'enzims de restricció endonucleasa:

tipus i: retallades no específica d'una distància superior a 1000 bp de la seva seqüència de reconeixement i conté activitats tant restricció i metilació.

Tipus II: Retallades a o a prop d'un curt i sovint cap (q.v.), seqüència de reconeixement. Enzim separada de A methylates la mateixa seqüència de reconeixement. Poden fer les retallades en les dues cadenes d'ADN exactament davant d'un altre i generar contundents acaba, o pot fer talls esglaonada per generar sticky extrems. El tipus II enzims de restricció són els explotats comunament a la tecnologia de l'ADN recombinant.

Tipus III: Talls de 24-26 bp aigües avall d'una seqüència de reconeixement curt, asimètrica. Requereix ATP i conté tant la restricció i metilació d'activitats.