Rompen las endonucleasas que reconocen secuencias específicas de base dentro de una hélice de ADN, creando una doble hebra de ADN.

Nota: restricción de las enzimas se unen a estos sitios de reconocimiento pero posteriormente cortar el ADN en sitios diferentes de tipo I. Enzimas de restricción de tipo II tanto enlazar y cortar dentro de sus sitios de reconocimiento o de destino.