Una classe di endonucleases che fende il DNA dopo aver riconosciuto una specifica sequenza, ad esempio, Bam H1 (5´GGATCC3´), Eco RI (5´GAATTC3´) e Hin dIII (5´AAGCTT3´). Ci sono tre tipi di enzimi di endonucleasi di restrizione:

i: tipo di tagli non specifico di una distanza maggiore di 1000 bp dalla sua sequenza di riconoscimento e contiene attività di metilazione e restrizione.

Tipo II: Tagli a o vicino a breve e spesso palindromo (q.v.), sequenza di riconoscimento. A separata enzima metila la stessa sequenza di riconoscimento. Possono fare tagli in due filamenti di DNA esattamente di fronte a uno a altro e generare smussati finisce o può fanno tagli sfalsati per generare estremità appiccicosa. Enzimi di restrizione tipo II sono quelli comunemente sfruttati nella tecnologia del DNA ricombinante.

Di tipo III: taglia 24-26 bp a valle da una sequenza di riconoscimento corto e asimmetrico. Richiede ATP e contiene attività di metilazione e restrizione.